Técnicas de Radioinmunoanálisis

Métodos Basados en la unión Ag-Ac

R. González, R. Tarazona, M.D. Galiani, G. Bugella y J. Peña

INTRODUCCIÓN.

Gran parte de los progresos alcanzados por la biología moderna se deben al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medida. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de sustancias de interés en biología animal y vegetal difíciles de medir empleando los métodos bioquímicos habituales.

Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas)  hacen que estos métodos se empleen ampliamente.

Existen diversos métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión

Ag-Ac (Tabla 17.1).

TABLA 17.1.

Principales métodos analíticos basados en la unión Ag-Ac

  

Así tenemos:

1. Técnicas de aglutinación. Cuando el antígenos e encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.

2. Técnicas de fluorescencia y citometría de flujo. Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.

3. Técnicas de radioinmunoensayo. En estas técnicas al anticuerpo se une un isótopo radiactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag-Ac a través de la radiactividad emitida.

4. Cromatografía de afinidad. La especificidad de la unión Ag-Ac puede utilizarse para obtener Acs y Ags puros.

5. Inmunoprecipitación e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antígenos y anticuerpos específicos.

El radioinmunoensayo (RIA) se basa en la competencia que se establece, para unirse a anticuerpos específicos, entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma

sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar, menor será la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa (ver esquema anexo).

Este tipo de reacción se encuentra esquematizado en la Figura 17.11. Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre mediante un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solución y la hormona unida al anticuerpo forma agregados fácilmente precipitables.

Una vez medida la radiactividad se construye una curva con los resultados obtenidos con cantidades conocidas de hormona sin marcar y marcada. A esta curva se llevan los valores obtenidos de los sueros problema y se obtiene la concentración de la hormona no marcada a

investigar.

En el RIA directo, a la fase sólida se une una cantidad conocida de Ac. Diferentes concentraciones conocidas de antígeno marcado se incuban con una concentración constante de la muestra de la que se desea conocer la concentración del antígeno en cuestión.

El fundamento y la detección no sufrirían cambios respecto lo anteriormente comentado. El RIA de inhibición también sería una técnica competitiva de análisis pero lo que se une a la fase sólida es una cantidad fija de antígeno.

Para el proceso de inhibición se incuba una concentración fija de anticuerpo marcado frente a una serie de diluciones de la muestra que contiene el antígeno.

Existe una técnica no competitiva que es el denominado sandwich: Se une un Ac en cantidades constantes a la fase sólida. Una vez realizado el bloqueo, se añade el antígeno en concentraciones variables. Posteriormente se añade un segundo anticuerpo contra el antígeno, pero esta vez marcado.

 Además del radioinmunoensayo antes descrito hemos de considerar que, en la actualidad, es cada vez más frecuente el empleo de inmunoglobulinas marcadas con isótopos radiactivos para su posterior aplicación en diferentes campos: trazador en determinaciones in vitro de antígenos específicos, en técnicas inmunorradiohistológicas y técnicas de análisis no competitivo que pueden ser una alternativa al RIA en la determinación de algunas moléculas que no pueden ser marcadas directamente con radioyodo, en la detección de tumores primarios o metastáticos (inmunoescintografía) e incluso la posibilidad de irradiación local de células neoplásicas (inmunorradioterapia).

Todas las posibilidades anteriormente indicadas se basan en la posibilidad de marcar el anticuerpo con radioyodo sin mermar su inmunorreactividad. El marcaje de proteínas o

péptidos con yodo radiactivo I125 ó I132 puede realizarse por diferentes métodos. La incorporación del yodo a la molécula se realiza en los aminoácidos aromáticos que forman parte de la estructura de la cadena peptídica: tiroxina, fenilalanina, triptófano o histidina. La técnica del radioinmunoensayo posee algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de utilizar isótopos. Además de su peligrosidad y la obligatoriedad de disponer de instalaciones adecuadas para su utilización, existen isótopos que tienen el inconveniente de su pronta caducidad.